Baltymų išskyrimas amonio sulfatu: metodai, principai ir taikymas

Įvadas

Baltymų išskyrimas ir gryninimas yra esminiai procesai biochemijos, biotechnologijos ir molekulinės biologijos srityse. Šie procesai leidžia atskirti ir koncentruoti specifinius baltymus iš sudėtingų biologinių mišinių, tokių kaip ląstelių lizatai ar audinių ekstraktai. Išgryninti baltymai naudojami įvairiems tikslams, įskaitant baltymų struktūros ir funkcijos tyrimus, vaistų kūrimą, diagnostinių testų kūrimą ir pramoninę fermentų gamybą. Vienas iš plačiai naudojamų baltymų išskyrimo metodų yra išsodinimas amonio sulfatu. Šis metodas remiasi baltymų tirpumo skirtumais didelėse druskų koncentracijose.

Baltymų išskyrimo amonio sulfatu principai

Amonio sulfatas ((NH₄)₂SO₄) yra labai tirpi druska, dažnai naudojama baltymams išskirti, nes ji nesukelia baltymų denatūracijos. Išsodinimas amonio sulfatu, dar vadinamas išsūdymu, yra metodas, pagrįstas baltymų tirpumo mažėjimu didelėse druskų koncentracijose. Baltymų tirpumas priklauso nuo hidrofobinių ir hidrofilinių sąveikų tarp baltymo molekulės ir ją supančio tirpiklio (dažniausiai vandens).

Išsūdymas

Išsūdymas yra procesas, kurio metu didelės druskos koncentracijos pašalina vandens molekules, kurios paprastai supa baltymo molekulę. Druskos jonai konkuruoja su baltymų molekulėmis dėl sąveikos su vandeniu. Kai druskos koncentracija didėja, vandens molekulės labiau linkusios sąveikauti su druskos jonais nei su baltymu. Dėl to hidrofobinės baltymo sritys tampa labiau veikiamos, o tai skatina baltymo molekulių agregaciją ir iškritimą iš tirpalo.

Druskos koncentracijos įtaka

Skirtingi baltymai išsiskiria iš tirpalo esant skirtingoms amonio sulfato koncentracijoms. Šis skirtumas leidžia frakcionuotai išskirti baltymus, palaipsniui didinant amonio sulfato koncentraciją ir surenkant nuosėdas kiekviename etape. Baltymų, turinčių daugiau hidrofobinių paviršių, išsodinimui reikia mažesnės amonio sulfato koncentracijos, o baltymų, turinčių daugiau hidrofilinių paviršių, išsodinimui reikia didesnės koncentracijos.

Izoelektrinis taškas

Baltymo tirpumas taip pat priklauso nuo pH. Baltymo tirpumas yra mažiausias, kai pH yra lygus baltymo izoelektriniam taškui (pI). Izoelektrinis taškas yra pH reikšmė, kurioje baltymo molekulė neturi grynojo elektrinio krūvio. Todėl, norint efektyviau nusodinti baltymą, rekomenduojama naudoti pH, artimą baltymo pI.

Taip pat skaitykite: Straipsnis apie maisto baltymus

Amonio sulfato išsodinimo procedūra

Amonio sulfato išsodinimo procedūra paprastai apima šiuos etapus:

1. Mėginio paruošimas: Pradinis mėginys (pvz., ląstelių lizatas) paruošiamas pašalinant ląstelių nuolaužas ir kitas netirpias medžiagas centrifugavimu arba filtravimu.
2. Amonio sulfato pridėjimas: Amonio sulfatas palaipsniui pridedamas prie mėginio, nuolat maišant, kad būtų užtikrintas tolygus pasiskirstymas. Pradedama nuo mažos koncentracijos, pvz., 20% prisotinimo, ir palaipsniui didinama iki norimos koncentracijos.
3. Inkubavimas: Mėginys inkubuojamas tam tikrą laiką (pvz., 1-2 valandas) maišant, kad baltymai galėtų agreguotis ir iškristi.
4. Centrifugavimas: Mėginys centrifuguojamas, kad nuosėdos būtų atskirtos nuo tirpalo. Nuosėdos, kuriose yra nusodinti baltymai, surenkamos.
5. Resuspendavimas: Nuosėdos resuspenduojamos tinkamame buferiniame tirpale. Buferinis tirpalas parenkamas atsižvelgiant į tolesnius baltymų tyrimo etapus.
6. Dializė arba desalinimas: Resuspenduotas baltymų tirpalas dializuojamas arba desalinuojamas, kad būtų pašalintas amonio sulfatas. Dializė atliekama naudojant membraną, kuri praleidžia mažas molekules, tokias kaip amonio sulfatas, bet sulaiko baltymus. Desalinimui gali būti naudojamos kolonėlės su sefadeksu.

Amonio sulfato išsodinimo privalumai ir trūkumai

Privalumai:

• Ekonomiškumas: Amonio sulfatas yra pigi ir lengvai prieinama druska.
• Efektyvumas: Metodas efektyviai koncentruoja baltymus ir pašalina didelę dalį teršalų.
• Švelnus metodas: Amonio sulfatas retai denatūruoja baltymus, todėl išsaugomas jų biologinis aktyvumas.
• Universalumas: Metodas gali būti taikomas įvairiems baltymams išskirti.

Trūkumai:

• Mažas selektyvumas: Metodas nesuteikia didelio selektyvumo, todėl reikia papildomų gryninimo etapų.
• Druskos pašalinimas: Būtina pašalinti amonio sulfatą prieš tolesnius tyrimus, nes didelės druskos koncentracijos gali trukdyti kitiems metodams.
• Baltymų tirpumas: Kai kurie baltymai gali būti sunkiai ištirpinami po išsodinimo.

Kiti baltymų išskyrimo metodai

Be amonio sulfato išsodinimo, yra ir kitų baltymų išskyrimo metodų, tokių kaip:

• Afininė chromatografija: Šis metodas naudoja specifinį ligandą, kuris prisijungia prie norimo baltymo.
• Jonų mainų chromatografija: Šis metodas atskiria baltymus pagal jų krūvį. Stacionarinė fazė susideda iš įkrautų dervų, kurios pritraukia priešingo krūvio baltymus. Baltymų eliucija atliekama keičiant druskos koncentraciją arba pH. Jonų mainų chromatografija yra labai efektyvus metodas baltymams išvalyti, pagrįstas jų krūvio savybėmis.
• Dydžio atskyrimo chromatografija (gelio filtracija): Šis metodas atskiria baltymus pagal jų molekulinę masę.
• Hidrofobinė sąveikos chromatografija: Šis metodas atskiria baltymus pagal jų hidrofobiškumą.
• Ultrafiltracija: Ultrafiltracija yra membraninės filtracijos tipas, naudojamas baltymams koncentruoti ir išvalyti. Šis metodas naudoja pusiau pralaidžią membraną, leidžiančią mažiems molekulėms praeiti, o stambios molekulės, tokios kaip baltymai, sulaikomos. Ultrafiltracija yra švelnus ir efektyvus būdas baltymams koncentruoti ir pašalinti teršalus, tokius kaip druskos ir maži baltymai.
• Nusodinimas organiniais tirpikliais: Organiniai tirpikliai, tokie kaip etanolis arba acetonas, gali būti naudojami baltymams nusodinti. Šis metodas remiasi tuo, kad organiniai tirpikliai mažina vandens dielektrinę konstantą, todėl mažėja baltymų tirpumas.
• Nusodinimas polimerais: Polimerai, tokie kaip polietilenglikolis (PEG), gali būti naudojami baltymams nusodinti. Šis metodas remiasi tuo, kad polimerai atitraukia vandenį nuo baltymų paviršiaus, todėl jie agreguojasi ir iškrenta iš tirpalo.

Lizocimo išskyrimas iš vištos kiaušinio baltymo

Lizocimas yra fermentas, natūraliai randamas vištos kiaušinio baltyme, pasižymintis antibakterinėmis savybėmis. Lizocimo išskyrimui iš kiaušinio baltymo gali būti naudojamas amonio sulfato išsodinimas.Pirmiausia kiaušinio baltymas atskiriamas nuo trynio ir praskiedžiamas buferiniu tirpalu. Tada palaipsniui pridedamas amonio sulfatas, nuolat maišant, kol pasiekiama norima koncentracija. Po inkubacijos mėginys centrifuguojamas, o nuosėdos, kuriose yra lizocimas, surenkamos. Nuosėdos resuspenduojamos buferiniame tirpale ir dializuojamos, kad būtų pašalintas amonio sulfatas. Išgrynintas lizocimas gali būti toliau analizuojamas ir naudojamas įvairiems tikslams.

Baltymų kiekio nustatymas

Po baltymų išskyrimo svarbu nustatyti baltymų koncentraciją. Yra įvairių metodų baltymų kiekiui nustatyti, įskaitant:

• Bradford metodas: Bradford metodas yra plačiai naudojamas baltymų koncentracijai nustatyti. Jis remiasi baltymų gebėjimu prisijungti prie Coomassie Brilliant Blue G-250 dažų, sukeliant spalvos pokytį, kuris matuojamas spektrofotometriškai. Metodas yra greitas, jautrus ir patogus, todėl tinka įvairiems baltymų mėginiams. Tačiau jis gali būti veikiamas trukdžių iš tam tikrų medžiagų, tokių kaip detergentai ir buferiai. Rinkoje yra įvairių spektrofotometrų, skirtų Bradford metodu pagrįstiems baltymų kiekybiniams tyrimams atlikti. Šie prietaisai skiriasi jautrumu, tikslumu ir automatizavimo lygiu.
• Lowry metodas: Lowry metodas yra kitas populiarus metodas baltymų koncentracijai nustatyti. Jis remiasi baltymų reakcija su Folin-Ciocalteu reagentu, sukeliant spalvos pokytį, kuris matuojamas spektrofotometriškai. Lowry metodas yra jautresnis nei Bradford metodas, tačiau jis yra labiau veikiamas trukdžių iš tam tikrų medžiagų.
• Biuret metodas: Biuret metodas yra senesnis metodas baltymų koncentracijai nustatyti. Jis remiasi baltymų reakcija su vario jonais šarminėje terpėje, sukeliant spalvos pokytį, kuris matuojamas spektrofotometriškai. Biuret metodas yra mažiau jautrus nei Bradford ir Lowry metodai, tačiau jis yra mažiau veikiamas trukdžių.
• UV absorbcijos metodas: UV absorbcijos metodas remiasi baltymų gebėjimu absorbuoti ultravioletinę šviesą. Baltymų koncentracija gali būti nustatyta matuojant absorbciją prie 280 nm. Šis metodas yra greitas ir paprastas, tačiau jis yra mažiau jautrus nei kiti metodai.

Baltymų grynumo įvertinimas

Po baltymų išskyrimo ir koncentracijos nustatymo svarbu įvertinti baltymų grynumą. Yra įvairių metodų baltymų grynumui įvertinti, įskaitant:

Taip pat skaitykite: Teigiamos emocijos

• SDS-PAGE elektroforezė: SDS-PAGE (natrio dodecilsulfato poliakrilamido gelio elektroforezė) yra metodas, naudojamas baltymams atskirti pagal jų molekulinę masę. SDS denatūruoja baltymus ir suteikia jiems neigiamą krūvį, todėl jie migruoja per gelį elektriniame lauke. SDS-PAGE yra galingas įrankis baltymų grynumui, molekulinei masei ir santykinei gausai įvertinti. Tai taip pat gali būti naudojama baltymų modifikacijoms, tokioms kaip glikozilinimas ir fosforilinimas, nustatyti.
• Izoelektrinis fokusavimas: Izoelektrinis fokusavimas yra metodas, naudojamas baltymams atskirti pagal jų izoelektrinį tašką (pI). Baltymų mišinys yra veikiamas pH gradiento, todėl baltymai migruoja tol, kol pasiekia savo pI, kur jie sustoja.
• Chromatografija: Chromatografijos metodai, tokie kaip jonų mainų chromatografija ir dydžio atskyrimo chromatografija, gali būti naudojami baltymų grynumui įvertinti. Jei baltymas yra grynas, chromatogramoje turėtų būti vienas pagrindinis pikas.
• Spektrometrijos metodai: Spektrometrijos metodai, tokie kaip masės spektrometrija, gali būti naudojami baltymų grynumui ir tapatybei patvirtinti.

Taip pat skaitykite: Kraujo judėjimo iššūkiai

tags: #baltymu #issodinimo #priklausomybe #nuo #amonio #isotinimo