Įvadas
Baltymų nusodinimas - tai procesas, kurio metu baltymai atskiriami nuo tirpalo, dažniausiai naudojant tam tikrus reagentus, kad sumažėtų jų tirpumas. Šis metodas yra plačiai taikomas biochemijoje ir molekulinėje biologijoje, siekiant koncentruoti baltymus, juos išgryninti arba pašalinti trukdančius komponentus iš mėginio. Vienas iš dažniausiai naudojamų reagentų baltymų nusodinimui yra amonio sulfatas. Šiame straipsnyje aptariamas amonio sulfato panaudojimas baltymų nusodinimui, jo veikimo principas, privalumai ir trūkumai, bei pateikiami pavyzdžiai, kaip šis metodas taikomas praktikoje.
Baltymų savybės ir tirpumas
Baltymai yra didelės molekulinės masės junginiai, sudaryti iš aminorūgščių, sujungtų peptidiniais ryšiais. Jų molekulinė masė svyruoja nuo kelių tūkstančių iki kelių milijonų, o tai lemia didelę baltymų įvairovę. Baltymų molekulės turi laisvas karboksilo ir amino grupes, todėl jų krūvis priklauso nuo terpės pH. Kiekvienam baltymui būdinga tam tikra pH reikšmė, vadinama izoelektriniu tašku (pI), kurioje baltymas neturi jokio grynojo elektrinio krūvio ir yra neutralus.
Baltymų tirpumas priklauso nuo daugelio veiksnių, įskaitant aminorūgščių sudėtį, molekulinę masę, struktūrą, pH ir druskų koncentraciją tirpale. Mažose koncentracijose druskos gali stabilizuoti baltymų molekules, tačiau didelėmis koncentracijomis druskos gali arba stabilizuoti, arba denatūruoti baltymus.
Baltymų nusodinimo metodai
Yra įvairių metodų, naudojamų baltymams nusodinti, įskaitant:
- Nusodinimas organiniais tirpikliais (pvz., acetonu, etanoliu).
- Nusodinimas koncentruotomis mineralinėmis rūgštimis.
- Nusodinimas sunkiųjų metalų druskomis.
- Nusodinimas alkaloidų reagentais.
- Išsūdymas (nusodinimas druskomis, pvz., amonio sulfatu).
Amonio sulfato panaudojimas baltymų nusodinimui
Amonio sulfatas yra viena iš dažniausiai naudojamų druskų baltymų išsūdymui. Išsūdymas remiasi baltymų tirpumo mažėjimu didelės koncentracijos druskų tirpaluose.
Taip pat skaitykite: Baltymų išskyrimo metodai
Veikimo principas
Didelės amonio sulfato koncentracijos atveju, druskos jonai konkuruoja su baltymų molekulėmis dėl vandens molekulių. Druskų jonams atėmus hidratuotą vandenį, baltymų molekulės sukimba į didesnius agregatus, kurie ir iškrenta nuosėdomis. Toks procesas vadinamas išsūdymu.
Privalumai
- Efektyvus ir plačiai taikomas baltymų nusodinimo metodas.
- Amonio sulfatas yra labai tirpus vandenyje, todėl galima pasiekti dideles druskos koncentracijas.
- Amonio sulfatas yra santykinai nebrangus ir lengvai prieinamas.
- Amonio sulfatas dažniausiai nedentūruoja baltymų, todėl jie gali būti vėl ištirpinti ir naudojami tolesniuose tyrimuose.
Trūkumai
- Amonio sulfato nuosėdose gali likti druskos priemaišų, kurias reikia pašalinti dializuojant baltymų tirpalą arba naudojant sefadeksą.
- Amonio sulfato nusodinimas gali būti mažiau selektyvus nei kiti baltymų atskyrimo metodai, todėl gali nusodinti ir nepageidaujamus baltymus.
Praktinis taikymas
Amonio sulfato nusodinimas gali būti naudojamas frakcionuotam baltymų atskyrimui. Skirtingi baltymai iškrenta nuosėdomis esant skirtingoms amonio sulfato koncentracijoms. Pavyzdžiui, globulinai iškrinta esant mažesnei amonio sulfato koncentracijai nei albuminai.
Pavyzdys
- Į mėgintuvėlį įpilama 5 ml baltymų tirpalo (albuminų ir globulinų).
- Pridedama gerai susmulkinto NaCl tiek, kad tirpalas būtų sotus. Po kelių minučių iškrenta globulinų nuosėdos, kurios nufiltruojamos.
- Filtrate lieka albuminai. Filtratą parūgštinus 1 lašu 1% acto rūgšties ir pavirinus, iškrenta albuminų nuosėdos.
Arba:
- Į mėgintuvėlį įpilama ir gerai sumaišoma 5 ml baltymų ir 5 ml sotaus amonio sulfato tirpalo. Iškrinta globulinai, kurie po 5 min. nufiltruojami.
- Į filtratą pridedama gerai susmulkinto amonio sulfato tiek, kad tirpalas būtų sotus. Iškrinta albuminų nuosėdos.
Baltymų izoelektrinio taško nustatymas
Baltymų izoelektrinis taškas (pI) yra pH, kuriame baltymas neturi jokio grynojo elektrinio krūvio. Šis rodiklis yra svarbus norint suprasti baltymo biocheminę funkciją ir elgseną įvairiose aplinkose.
Svarba
Baltymo pI yra labai svarbus norint suprasti jo biocheminę funkciją. Kai pH = pI, baltymo tirpumas yra minimalus, jis linkęs koaguliuoti - sudaryti nuosėdas. Norint baltymą nusodinti, tikslinga daryti pH artimą pI.
Taip pat skaitykite: Reakcijos greičio priklausomybė
Įtaka
Polipeptidų pI labai priklauso nuo jonizuojamų grupių disociacijos konstantos. Pagrindinės aminorūgštyse esančios jonizuojamosios grupės yra argininas, aspartatas, cisteinas, histidinas, glutamatas, lizinas ir tirozinas, kurios vaidina svarbų vaidmenį nustatant baltymo pI. Tačiau baltymų modifikacijos ir posttransliacijos modifikacijos taip pat gali vaidinti reikšmingą vaidmenį nustatant baltymo pI. Būdingas baltymo pI pirmiausia grindžiamas jo natūralių baltymų seka.
Taikymas
Globulos elektriniu krūviu pagrįsti svarbiausi baltymų atskyrimo ir gryninimo metodai: elektroforezė ir jonų mainų chromatografija.
Kiti baltymų atskyrimo ir gryninimo metodai
Be amonio sulfato nusodinimo, yra ir kitų metodų, naudojamų baltymams atskirti ir išgryninti:
- Dializė: naudojama pašalinti druskų priemaišas iš baltymų tirpalo.
- Gelfiltracija: metodas, paremtas baltymų skirtinga molekuline mase.
- Ultracentrifugavimas: taip pat paremtas baltymų skirtinga molekuline mase. Sedimentacijos greitis proporcingas jų molekulinei masei.
- Baltymų elektroforezė: remiasi tuo, kad esant tam tikrai pH ir tirpalo joninei jėgai elektriniame lauke, baltymai juda greičiu, proporcingu jų suminiam krūviui.
- Jonų mainų chromatografija: kaip ir elektroforezė, remiasi suminio krūvio skirtingumu. Naudojami polimerai, turintys skirtingo krūvio funkcines grupes (jonų mainų).
- Giminingumo (afininė) chromatografija: remiasi skirtinga baltymų sąveika su ligandais, kurie yra pritvirtinti (imobilizuoti) prie kieto nešiklio. Ligandai gali būti substratas arba kofermentas. Prie ligandų jungiasi tik baltymas. Ši sąveika yra specifinė. Visi kiti baltymai patenka į eliuatą.
- Afininė chromatografija: yra labai selektyvus metodas, kuris naudoja specifinį prisijungimo ligandą baltymams atskirti pagal jų afinitetą.
- Dviejų fazių atskyrimas vandeniniais polimerais: naudoja dviejų nesimaišančių polimerų, tokių kaip polietilenglikolis ir dekstranas, sistemą baltymams atskirti pagal jų hidrofobines savybes.
- Hidrofobinė sąveikos chromatografija: atskiria baltymus pagal jų hidrofobiškumą.
- Dydžio atskyrimo chromatografija: atskiria baltymus pagal jų molekulinę masę.
Lizocimo išskyrimas iš vištos kiaušinio baltymo
Lizocimas, natūraliai randamas vištos kiaušinio baltyme, pasižymi unikaliomis antibakterinėmis ir antioksidacinėmis savybėmis. Šiame skyriuje aptariami įvairūs metodai, naudojami lizocimui išgryninti iš vištos kiaušinio baltymo.
Gryninimo procesas
Gryninimo procesas paprastai apima kelis etapus, įskaitant ląstelių sutrikimą, atskyrimą ir chromatografiją.
Taip pat skaitykite: Tirpalų laidumo priklausomybė
Baltymų kiekio nustatymas Bradford metodu
Bradford metodas yra plačiai naudojamas baltymų koncentracijai nustatyti. Šis metodas pagrįstas baltymų gebėjimu prisijungti prie Coomassie Brilliant Blue G-250 dažų, sukeliant spalvos pokytį, kuris matuojamas spektrofotometriškai. Metodas yra greitas, jautrus ir patogus, todėl tinka įvairiems baltymų mėginiams. Tačiau jis gali būti veikiamas trukdžių iš tam tikrų medžiagų, tokių kaip detergentai ir buferiai.
SDS-PAGE analizė
SDS-PAGE (natrio dodecilsulfato poliakrilamido gelio elektroforezė) yra metodas, naudojamas baltymams atskirti pagal jų molekulinę masę. SDS denatūruoja baltymus ir suteikia jiems neigiamą krūvį, todėl jie migruoja per gelį elektriniame lauke. SDS-PAGE yra galingas įrankis baltymų grynumui, molekulinei masei ir santykinei gausai įvertinti. Tai taip pat gali būti naudojama baltymų modifikacijoms, tokioms kaip glikozilinimas ir fosforilinimas, nustatyti.
Jonų mainų chromatografija
Jonų mainų chromatografija yra metodas, naudojamas baltymams atskirti pagal jų krūvį. Stacionarinė fazė susideda iš įkrautų dervų, kurios pritraukia priešingo krūvio baltymus. Baltymų eliucija atliekama keičiant druskos koncentraciją arba pH. Jonų mainų chromatografija yra labai efektyvus metodas baltymams išvalyti, pagrįstas jų krūvio savybėmis.
Ultrafiltracija
Ultrafiltracija yra membraninės filtracijos tipas, naudojamas baltymams koncentruoti ir išvalyti. Šis metodas naudoja pusiau pralaidžią membraną, leidžiančią mažiems molekulėms praeiti, o stambios molekulės, tokios kaip baltymai, sulaikomos. Ultrafiltracija yra švelnus ir efektyvus būdas baltymams koncentruoti ir pašalinti teršalus, tokius kaip druskos ir maži baltymai.
Rinkoje parduodami aparatai ir jų palyginimas
Rinkoje yra įvairių spektrofotometrų, skirtų Bradford metodu pagrįstiems baltymų kiekybiniams tyrimams atlikti. Šie prietaisai skiriasi jautrumu, tikslumu ir automatizavimo lygiu. SDS-PAGE analizė atliekama naudojant elektroforezės įrangą, kurią sudaro maitinimo šaltinis, elektroforezės kamera ir geliai. Jonų mainų chromatografijai naudojamos chromatografijos kolonos, užpildytos jonų mainų dervomis. Rinkoje yra įvairių tipų dervų, skirtų skirtingiems baltymams atskirti. Ultrafiltracijos įranga apima membranas ir filtracijos sistemas.
Metodų alternatyvos
Be tradicinių metodų, tokių kaip amonio sulfato nusodinimas ir dializė, galima naudoti ir kitus baltymų atskyrimo metodus, įskaitant afininę chromatografiją ir dviejų fazių atskyrimą vandeniniais polimerais. Alternatyvūs metodai jonų mainų chromatografijai apima hidrofobinę sąveikos chromatografiją ir dydžio atskyrimo chromatografiją.
tags: #amonio #sulfato #koncentracijos #priklausomybe #baltymo